pGala-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本产品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 由于本载体以pUC18载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。此外，本产品中的高效连接液Solution I可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。本产品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control反应。

■ Control Insert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。

■ 进行TA克隆，克隆PCR产物。

■ 对克隆后的PCR产物使用BcaBESTTM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。

1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 μl。

pGala-T Vector*1             1μl

Control Insert*2             1μl

dH2O                         3μl

2）加入5 μl（等量）的 Solution I。

3）16℃反应30分钟。

注： ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

② 5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

4）全量（10 μl）加入至100 μl JM109或其他感受态细胞中，冰中放置30分钟。

5）42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。

6）加入890 μl SOC或LB培养基，37℃振荡培养60分钟。

7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

8）挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5×10⁸ cfu/μgp UC19 DNA。

 

* 效率是指白色菌落中的目的DNA Insert片段的连入效率。

 

 

 

 

 

 

1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为       5 μl

pGala-T Vector*1                           1 μl

Insert DNA*3                  0.1 pmol～0.3 pmol

dH2O up to                                 5 μl

2）加入5 μl（等量）的 Solution I。

3）16℃反应30分钟。

注）① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

② 5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

③ 长片段PCR产物（2 kbp以上）进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时。

4）全量（10 μl）加入至100 μl JM109或其他感受态细胞中，冰中放置30分钟。

5）42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。

6）加入890 μl SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。

7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

8）挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

取0.5 μl实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要确定T载体的使用量。pGala-T Vector 1μl（50 ng）的摩尔数约为0.03 pmol。

Control Insert为500 bp的3′末端带有A碱基的PCR产物，Control Insert 1 μl（50 ng）的摩尔数约为0.15pmol。

在进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1 ：2～10。

 

 

1.Solution I请于冰水中融解。

2.克隆时使用的Insert DNA片段（PCR产物）建议进行切胶回收纯化，否则PCR产物中的短片段 DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响TA克隆效率。

3. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 μl。当要转化的DNA量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。进行乙醇沉淀时使用galaxybio核酸共沉剂可以提高DNA的回收率。

4. 连接反应请在25℃以下进行，温度升高（>26℃）较难形成环状DNA。连接效率偏低时，可适当延长连接反应时间至数小时。

5. 本产品来源于pUC18载体，因此，适合pUC18载体的感受态细胞都可以使用，如：JM109等。

1. 感受态细胞的选择。

转化时请使用高效的热转化感受态细胞（转化效率≥1×10⁸ cfu/μg pUC19），这样才可能得到比较理想的阳性克隆。如果需要进行蓝白筛选时，宿主细胞必须具有正确的基因型（F’编码的［LacZ△M15］）产生 ω Fragment，才可能和载体DNA产生的LacZ α多肽相结合，表现出 β-半乳糖苷酶活性（α-互补性）。

2. Insert DNA的要求。

Insert DNA应该进行切胶回收的纯化处理后才进行载体连接，尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回时可使用galaxybio凝胶回收试剂盒。

3. Insert DNA使用量的计算方法。

进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比一般为1：2～10，我们可以根据自己的实验情况选择合适的Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA使用量的计算方法如下：

Insert DNA的使用量（ng）=nmol数×660×Insert DNA的bp数

本载体1 μl（50 ng）的摩尔数约为0.03 pmol。

4. 阳性克隆的检测。

DNA片段成功插入至pMD-18 Vector中后，一般情况下 β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。有报道称，2 kbp的DNA片段插入到载体中后，重组克隆体仍显示了蓝色。所以，当我们没有得到白色菌落时，可以试着检测蓝色菌落。进行阳性克隆检测时，我们建议使用PCR的方法，扩增用引物可以使用BcaBEST^M Sequencing Primers，可以对菌体直接进行PCR扩增。

为了确认实验操作的正确性以及实验试剂的有效性，我们建议进行阳性对照实验。按照实验操作方法，使用试剂盒中提供的Control Insert，可以进行10次阳性对照实验。

Q-1 怎样提高连接转化效率？

A-1 1. 确认Insert DNA片段的3’末端是否带有“A”尾。大部分的高保真DNA聚合酶（如：KOD、LAPower、Pfu等）扩增的PCR产物是平滑末端，不能直接进行TA克隆。

2. 纯化PCR产物。最好使用切胶回收的PCR片段，以除去PCR产物中的非特异性片段和引物等杂质。进行切胶回收时可以使用galaxybio凝胶回收试剂盒。

3. 请使用转化效率大于10⁸ cfu/μg pUC19 DNA的感受态细胞。

4. DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段DNA的克隆效率（连接效率与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，或采用电转化方法。

5. 进行切胶回收纯化DNA片段时，不要使DNA片段在紫外线下暴露时间过长。

6. Solution I应尽量避免反复冻融。

7. 建议使用新配制的平板培养基。

Q-2 转化后的菌落全为蓝色，但有目的DNA片段的插入，为什么？

A-2 插入的DNA片段较短（小于500 bp），且插入片段没有影响LacZ基因的读框，此时平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色（或淡蓝色）。

Q-3 欲对克隆DNA片段进行测序时，使用何种引物？

A-3 本载体来源于pUC18载体。因此，用于pUC18载体测序的通用引物都可以使用。