T4 DNA Ligase
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包装内容 |
100次
Cat:FP015 |
500次
Cat:FP010 |
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T4 DNA Ligase（350 U/μl） |
35,000 Units |
35,000 UnitsX5 |
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10×T4 DNA Ligase Buffer |
1 ml |
1ml X5 |
贮存条件：
-20℃保存
产品简介
该酶催化相邻DNA链的5’-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，需ATP作辅酶。本酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接，也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接，修复双链DNA、RNA、DNA/RNA杂交链中的单链切口
起源
Escherichia coli carrying the plasmid that enable highly expression of T4 DNA Ligase gene。
酶贮存溶液：
10 mM Tris-HCl (pH 7.5),
0.1 mM EDTA,
50 mM KCl,
1 mM DTT,
50% Glycerol
and 200 μg/ml Nuclease free BSA.
活性定义
在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。
本酶的1 U相当于ATP-PPi交换反应中0.008 Weiss Unit。
纯 度
1） 2,000 U的本酶和1 μg的λ-Hind III片段在37℃下反应24小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
2） 2,000 U的本酶和1 μg的Supercoiled pBR322 DNA在37℃下反应24小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
3） 2,000 U的本酶和1 μg的16S，23S rRNA在37℃下反应24小时，RNA
用 途
1）DNA片段和载体DNA的连接。
2）DNA片段和Linker或Adaptor DNA的连接。
使用注意
连接反应因末端碱基顺序的不同而反应速度各异，一般有下列倾向：
突出末端：Hind III＞Pst I＞EcoR I＞BamH I＞Sal I
平滑末端：Hae III＞Alu I＞Hinc II＞Sma I
EcoR V＞Sca I＞Pvu II＞Nru I
其中连接Hind III末端的速度约为连接Sal I末端速度的10～40倍；
而连接Hae III末端的速度约为连接Sma I末端速度的5～10倍。
附带10×Buffer组成（保存：-20℃）
10×T4 DNA Ligase Buffer
Tris-HCl（pH 7.6） 660 mM
MgCl 66 mM
DTT 100 mM
ATP 1 mM
* Buffer在融解时，如果出现少量沉淀属正常现象，请于37℃保温溶解后使用
使用举例
DNA片段和载体DNA的连接
1. 在微量离心管中制备下列连接反应液。
10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 μl
DNA片段* 约0.3 pmol
载体DNA** 约0.03 pmol
T4 DNA Ligase 1 μl
dH2O up to 25 μl
* DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3～10倍。
** 平滑末端的载体与DNA片段进行连接时，应首先将载体进行去
磷酸化处理，以防止其自身环化。
2. 16℃过夜反应。
3. 加入2.5 μl（1/10量）的3 M CH3COONa（pH5.2）。
4. 加入62.5 μl（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
5. 离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
6. 25～50 μl TE溶解，10～20 μl转化至100 μl的感受态细胞中。
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