产品简介
※ 本试剂盒采用经典的SDS碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅胶膜在高盐低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅胶膜上洗脱。
※ 具有高效率的内毒素去除液，有效去内毒素，经检测，一次分离即符合国家药典内毒素含量标准。非常适合转染、转化及动物免疫及各种分子生物学实验。
※ 快速、方便，从150～250 ml大肠杆菌LB（Luria Bertani）培养液中，可快速提取500～1000ug纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达85～90%。
※ 获得的质粒产量高，超螺旋比例高、纯度好。直接可以用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
操作步骤：
1.试验前准备及注意事项
a. 溶液S1 Resuspension Buffer 使用前将RNase A（使用前稍离心）全部加入，均匀混合后4℃保存并标示。
b. Wash Buffer 使用前请按标签加入无水乙醇并标示。
c. 使用前检查溶液S2、溶液S3各试剂是否有沉淀，若有请于37℃或微波炉稍加热溶解。S2可以在不烫手时使用，S3室温使用。
d. 溶液S2、溶液S3及去内毒素溶液S4用后拧紧瓶盖。
2. 收菌 取150～250ml 在LB 培养基中培养过夜的高拷贝数质粒菌液，或500 ml 过夜培养的低拷贝质粒/Cosmid菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），≥3,000×g 离心10 min，弃上清。将离心管倒置于纸巾上数分钟，除尽上清。
* 当过夜菌液大于250ml时，可以根据菌体量的多少，严格按比例适当加大Buffer S1、S2、S3的使用量，可以得到更好的收率。下表供参考。
培养过夜菌液和各溶液的关系（供参考）
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菌液 |
溶液S1 |
溶液S2 |
溶液S3 |
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150～250ml |
10ml |
10ml |
14ml |
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250～350ml |
12ml |
12ml |
17ml |
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500ml左右 |
14ml |
14ml |
20ml |
3. 重悬菌液 加10ml Buffer S1 悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小
菌块。
* 确认Buffer S1 中已加入RNase A。请充分重悬细菌，若不充分会导致碱裂解不完全。
4. 碱裂解 加10ml Buffer S2，温和并充分地上下翻转8-10 次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。
* Buffer S2 使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2 中和Buffer S2 中的NaOH，降低溶菌效率。
* 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA 的污染。
* 此步骤不宜超过5 min。
* 加Buffer S2 后裂解液会变成蓝色，充分混匀以保证形成均一的蓝色溶液。
5. 中和 加14ml的Buffer S3，温和并充分地上下翻转10-12 次混合均匀，直至形成紧实的凝集块，室温放置5 min。
* 加入Buffer S3 后应立即混合，以避免形成局部的凝结块。
* 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA 的污染。
* 加Buffer S3 后蓝色会消失，充分混匀以保证悬浮物中蓝色均消失。
6. 过滤 将上清全部转入过滤柱，一般可以靠重力过滤，也可适当3000×g 离心min，。
7. 去内毒素
a..将上述操作的上清液体转移另一离心管中(忌取到沉淀)，加10ml 去内毒素S4,振荡混匀，
b.不时振荡数次每次30秒。
c. 10,000 rpm,30℃离心5 min。
d. 溶液分为两相。上层水相含DNA，下层油状相含内毒素。
8. 柱结合.将含DNA的上层水相转移到吸附柱Spin Column中，弃层油状相。宁肯少提上层水相，也不要不要吸到中间层。一般一次抽提就可以符合标准；也可以根据需要重复抽提2次，即重复步骤a-d两次
10,000×g 离心2 min，弃滤液。如过滤不完全，可以适当延长离心时间。
9. 漂洗 将13ml的漂洗缓冲液 加入吸附柱中，10,000×g 离心（4°C）2 min,弃滤液。
10. 再漂洗 将13ml的漂洗缓冲液 加入吸附柱中，10,000×g 离心（4°C）2 min,弃滤液。 空柱10,000×g 离心（4°C）2 min，除去残留乙醇。
11. 洗脱 将吸附柱置于洁净的50 ml 离心管中，在吸附柱的膜中央上加1.5 ～3.5ml Elution Buffer，室温 静置5 min。≥10,000×g 离心5 min 收集质粒DNA。
注意：Elution Buffer 组成为2.5mM Tris-HCI (pH8.5),不影响测序和酶切反应，把水或洗脱液加热于65℃使用时有利于提高洗脱液效率，如果提取的质粒>10kb，请将洗脱液预热至65℃，并适当延长洗脱时间。
质粒DNA浓度和纯度检测
OD260值为1，相当于50ug/ml的双链DNA。也可以通过DNA Marker通过琼脂糖凝胶电泳半定量。
OD260/ OD280比值一般为1.7-1.8，如果洗脱时不使用缓冲液，而使用去离子水，由于受PH值和离子浓度的影响，比值会偏低。
超纯质粒DNA大量提取试剂盒
（去内毒素、去蛋白）
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试剂盒内容 |
10 TESTS
Cat:FP093 |
50 TESTS
Cat:FP094 |
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RNaseA (10mg/ml) |
300ul×5 |
300ul×25 |
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溶液S1 Resuspension Buffer |
125ml |
125 ml×5 |
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溶液S2 Lysis Buffer |
125ml |
125 ml×5 |
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溶液S3 Neutralization Buffer |
145ml |
145 ml×5 |
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105ml |
105 ml×5 |
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漂洗缓冲液Wash Buffer |
30 ml×2 |
30 ml×10 |
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洗脱缓冲液 Elution Buffer |
15 ml×2 |
15ml×10 |
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过滤柱 Filter Column |
10 |
50 |
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吸附柱 Spin Column |
10 |
50 |
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收集管 Collection Tube(50ml) |
20 |
100 |
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说明书 Specification |
1 |
1 |
贮存条件：
室温，有效期一年。溶液S1加入RNase后2-8℃保存 | 
