一、 简介
Protein G是从G类Streptococci细菌中分离出来的胞壁蛋白,与多数哺乳动物的IgG Fc段结合(包括:人、山羊、绵羊、兔、豚鼠、马、猪、猴、小鼠等),分子量:25kDa。Protein G可用于纯化不能与Protein A很好结合的哺乳动物单抗和多抗IgG的纯化。相对于Protein A,Protein G对于大多数哺乳动物的IgG有着更高的亲和力,尤其是对于IgG的亚基,如人 IgG3,小鼠IgG1和鼠 IgG2a。与Protein A不同,Protein G不与狗IgG结合、不结合人IgM,IgD,或IgA。
重组蛋白G(Recomb Protein G)已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点,减少了交叉反应和非特异性结合。因此,它比天然蛋白G和蛋白A有更大的亲和力。可以代替二抗,广泛应用于免疫化学等领域。在亲和力、稳定性等方面好。
本产品将我公司自主设计和生产的新型重组蛋白G偶联到环氧活化的琼脂糖凝胶6B上,成为用于抗体分离纯化的亲和层析介质
本产品稳定性好,基团脱落少,使用寿命长,使用方便,可从腹水或培养液中直接分离纯化抗体。
由于采用了环氧活化的方法,与溴化氰活化方法相比,可获得长短更适合的结合臂,使抗体纯化获得更好的效果。并且这种方法活化的琼脂糖凝胶没有离子交换的作用,因而其死吸附少。
二、 亲和介质特性:
特点 |
基团脱落少,结合特异性强 |
基质 |
6% 的交联琼脂糖凝胶 |
配基 |
重组蛋白G |
配基密度 |
≈6mg 重组蛋白G/ml |
吸附载量 |
3-7mg 鼠IgG2a/ml |
亲和介质的颗粒大小 |
50-160μm |
最大流速 |
200cm/h |
pH 范围 |
3-10 ,在位清洗时pH 范围可到2-11 |
使用温度 |
常温 |
保存温度 |
+4~8℃ |
保存液体 |
20% 乙醇 |
三、 适用范围
Protein A和Protein G的相对结合强度
物种物种 |
亚类亚类 |
protein A 结合 |
protein G 结合 |
人 |
lgA |
可变 |
- |
|
lgD |
- |
- |
|
lgD |
- |
- |
|
lgG1 |
++++ |
++++ |
|
lgG2 |
++++ |
++++ |
|
lgG3 |
- |
++++ |
|
lgG4 |
++++ |
++++ |
|
lgM |
可变 |
- |
鸡蛋黄 |
lgY |
- |
- |
牛 |
|
++ |
++++ |
狗 |
|
++ |
+ |
山羊 |
|
- |
++ |
豚鼠 |
lgG1 |
+++ |
++ |
|
lgG2 |
+++ |
++ |
仓鼠 |
|
+ |
++ |
马 |
|
++ |
++++ |
考拉 |
|
- |
+ |
骆驼 |
|
- |
+ |
猴(恒河) |
|
++++ |
++++ |
小鼠 |
lgG1 |
+ |
++++ |
|
lgG2a |
++++ |
++++ |
|
lgG2b |
+++ |
+++ |
|
lgG3 |
++ |
+++ |
|
lgM |
可变 |
- |
猪 |
|
+++ |
+++ |
兔 |
|
++++ |
+++ |
大鼠 |
lgG1 |
- |
+ |
|
lgG2a |
- |
++++ |
|
lgG2b |
- |
++ |
|
lgG3 |
- |
++ |
绵羊 |
|
+/- |
++ |
++++ =强结合,++ =中等结合,- =弱或不结
四、 缓冲液配制
建议采用磷酸缓冲液,洗脱后不影响下游的标记。
A缓冲液 1mol/L Na2HPO4.12H2O(MW358.14)……………… 358.14g
1500 mM NaCl l(MW68.08g/mol) ………………… 87.7g
溶于1升水,滤膜过滤
B缓冲液 1mol/L NaH2P04 (MW156.01) ………………………156.01g
1500 mM NaCl l(MW68.08g/mol) ………………… 87.7g
溶于1升水,滤膜过滤
C 吸附亲和洗涤缓冲液
根据所需PH值,按下表3配制。按照所列比例量取后混合,然后再加9倍体积的水,稀释成应用溶液。
如果洗脱下的抗体有些杂带,可加吐温-20至终浓度0.05%
D 推荐亲和缓冲液:A液77.4ml 、B液22.6ml;两液混合成PH7.4的亲和缓冲液,再加9倍体积的水,稀释成应用溶液
E 洗脱液 0.1mol/L NaH2P04 (MW156.01) ………………………15.601g
150 mM NaCl l(MW68.08g/mol) ……………………… 8.77g
溶于1升水,滤膜过滤,HCl调整PH至2.0~3.0
五、应用举例
A 实验名称:从小鼠腹水中分离纯化IgG2a
1、 重组蛋白G 琼脂糖凝胶装柱,柱床体积为1ml,流尽20%乙醇溶液;
2、 以缓冲液C平衡5-10个床体积,流速为1ml/min;(缓冲液C配制方法:取A液35.2ml、B液64.8ml,再加900ml水,混合后PH6.5).
3、 将0.2ml小鼠腹水用缓冲液C稀释到2ml,0.45μm 滤膜过滤,上样。流速为1ml/min;
4、 用缓冲液C再洗5-10 个床体积,流速为1ml/min;
5、 用洗脱液E,洗脱3体积。
6、 在洗脱液加入0.2体积中和缓冲液,以PH试纸确认溶液为中性。溶液太酸,会损伤抗体活性(中和缓冲液配制方法:A液77.4ml 、B液22.6ml;两液混合成PH7.4的中和缓冲液
7、 将分离纯化的IgG2a 与对照品同时进行SDS-PAGE 电泳分析。
8、 用纯水流洗10个柱床体积,再用20%的乙醇流洗10 个柱床体积,流速为2ml/min,
柱子置于+4~8℃环境中保存
表三,25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制
pH |
A液
1mol/L Na2HPO4(ml) |
B液
1mol/L NaH2PO4(ml) |
5.8 |
7.9 |
92.1 |
6.0 |
12.0 |
88.0 |
6.2 |
17.8 |
82.2 |
6.4 |
25.5 |
74.5 |
6.6 |
35.2 |
64.8 |
6.8 |
46.3 |
53.7 |
7.0 |
57.7 |
42.3 |
7.2 |
68.4 |
31.6 |
7.4 |
77.4 |
22.6 |
7.6 |
84.5 |
15.5 |
7.8 |
89.6 |
10.4 |
8.0 |
93.2 |
6.8 |
根据比例量取混合,然后在加9倍体积的水,稀释成应用溶液。
B 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):
(1)蛋白样品的准备:
1) 对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,PBS洗涤一次,然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。
3) 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
4) 对于悬浮细胞,离心收集细胞后,PBS洗涤一次,然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。
注: 详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材,参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高,可以用裂解液或PBS适当稀释,如果蛋白样品浓度过低,在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
(2). 去除非特异性结合(可选做):
1). 取200微升至1毫升蛋白样品,蛋白量约为200微克至1毫克,加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein A+G Agarose,4℃缓慢摇动30分钟至2小时。
2). 2500rpm(约1000g)离心5分钟,取上清用于后续的免疫沉淀。
注: 所谓种属相同的IgG是指,例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG,则在本步骤中可以加入normal mouse IgG,如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A+GAgarose的孵育,可以充分降低非特异性的结合,降低背景。
(3). 免疫沉淀:
1). 加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗,4℃缓慢摇动过夜。
2). 再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose,4℃缓慢摇动1-3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40微升。)
3). 2500rpm(约1000g)离心5分钟,或瞬时高速离心,小心吸除上清,注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A+GAgarose。
4). 用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次,裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。
5). 完成最后一次洗涤后,去除上清,加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀,瞬时高速离心把样品离心至管底。
6). 100℃或沸水浴处理3-5分钟,取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳,暂时不用的样品可以-20℃保存。
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