组织/细胞/细菌基因组DNA提取试剂盒
（蛋白酶K、离心柱型）
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试剂盒内容 |
50次
Cat：GG030 |
250次
Cat：GG040 |
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蛋白酶K（20mg/ml） |
1ml |
1ml×5 |
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溶液NS SolutionNS |
15 ml |
15 ml×5 |
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溶液BL Solution BL |
15ml |
15ml×5 |
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溶液W1 Buffer W1 |
20 ml |
20ml×5 |
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溶液W2 Buffer W2 |
15 ml |
15ml×5 |
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溶液TE Buffer TE |
10 ml |
10ml×5 |
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吸附柱 Spin Column |
50 |
250 |
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收集管 Collection Tube |
50 |
250 |
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说明书 Specification |
1 |
1 |
贮存条件：
蛋白酶K -20℃保存，有效期一年。其他室温保存。
产品简介：
※ 产品简介本试剂盒采用可以特异性结合 DNA 的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，用于提取组织细胞中的基因组DNA 。离心吸附柱中采用进口硅胶膜，吸附量大，产率高，高效、专一吸附 DNA实验结果可重复性好。采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA 片段大，纯度高，质量稳定可靠。
※ 提取的DNA可直接用于PCR/Real time PCR、限制性酶切、Southern blot、测序、mutant analysis和SNP等下游应用实验。
操作步骤：
1.试验前准备及注意事项
a. 试剂盒在第一次使用前请按试剂瓶标签说明在Buffer W1和Buffer W2中加入无水乙醇，并做好标记；溶液使用后，避免长期暴露于空气中，请及时盖紧盖子,密闭保存。
b. 若溶液BL中有沉淀，可在 56 ℃ 水浴中重新溶解，摇匀后使用
c. 使用前，请将水浴锅调整70℃，并将Buffer TE 置于70℃预热。
2. 材料处理
a. [动物组织]
取少量样本材料，放入液氮预冷的研钵中。快速用力研磨的同时加入少量液氮，直至样本材料被研磨成粉末。将研磨好的样本转移至1.5 ml离心管中，每管组织材料含量应不超过10 mg。
注意： 某些匀浆困难，或在匀浆过程中DNA容易降解的特殊组织应加液氮研磨。如DNA酶含量丰富的组织：肝脏、脾脏、胰腺、胸腺、淋巴等；胶原蛋白含量丰富的组织：皮肤、肌腱等；角质蛋白含量丰富或坚硬的组织：骨骼等。
如没有液氮。可用用剪刀剪成小块，放入研钵或匀浆器中，加入适量TE（pH 8.0），处理成细胞悬液。将不超过10 mg当量的细胞悬液转移至一个新的1.5 ml的离心管中， 12000 rpm离心1min，弃上清，收集沉淀。
每支离心管中的样本当量不宜超过10 mg。每10 mg样本材料可获得10 μg基因组DNA。样本量过大，将会影响细胞核裂解效率并可能堵塞纯化柱，进而降低基因组DNA的得率与纯度。
b. [细胞]
贴壁细胞：先用胰酶将贴壁细胞处理成细胞悬液，转移至1.5 ml离心管中12,000 rpm离心1min，弃上清。
悬浮细胞：直接取适量转移至1.5 ml离心管中12,000 rpm离心1min，弃上清。
注意：每只离心管内的细胞量不应超过1×106-107。
c. [细菌]
将0.1-1.5 mL过夜培养的菌液转移到 1.5 mL塑料离心管中， 12000-15000 g室温离心1分钟沉淀细菌，弃上清。 注意：：每只离心管内的细胞量不应超过1×10 6-10 74. 加入 200μl溶液NS重悬沉淀。
5. 加入 20μl 蛋白酶 K 溶液，混匀。(蛋白酶K可根据血量或白细胞量适当增减) 注意：如果需要去除 RNA ，可加入 4μl RNaseA溶液（100 mg/ml用户自备 ) ，
振荡15秒，室温放置 5 分钟
3. 加 200 μl溶液BL，充分颠倒混匀， 56 ℃ 放置 10 分钟，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮（如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止）。
注意：加入溶液BL时可能会产生白色沉淀，一般 56 ℃ 放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提DNA 量少和提取出的 DNA 不纯。
4. 加 220μl 无水乙醇，充分颠倒混匀，冷却至室温。此时可能会出现絮状沉淀。（涡旋震荡10s可以提高收率）
5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱（吸附柱放入收集管中） , 12,000 rpm （~13,400×g ）离心 30 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
6. 向吸附柱中加入700μl Buffer W1 （使用前请先检查是否已加入无水乙醇） , 12,000 rpm （~ 13,400×g ）离心 30 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
7. 向吸附柱中加入 700 μl Buffer W2（使用前请先检查是否已加入无水乙醇） , 12,000 rpm （~ 13,400×g ）离心 30 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
8. 再向吸附柱中加入 500 μl Buffer W2 , 12,000 rpm （~ 13,400×g ）离心 30 秒，倒掉收集管中的废液。
9. 将吸附柱放回收集管中， 12,000 rpm （~ 13,400×g ）离心 2 分钟，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。
10. 将吸附柱转入 1.5ml 离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50—200μl Buffer TE，室温放置 2—5 分钟（70℃保温得率更高）， 12,000 rpm （~ 13,400×g ）离心 2 分钟，将溶液收集到离心管中。
注意：若用水做洗脱液应保证其 pH 值在 7 .0—8 . 5 范围内（可以用 NaOH 将水的 pH 值调到此范围） , pH 值低于 7 . 0 会降低洗脱效率：且 DNA 产物应保存在 -20 ℃ ，以防 DNA 降解。
DNA定量及纯度检测
OD260值为1，相当于50ug/ml的双链DNA。也可以通过DNA Marker通过琼脂糖凝胶电泳半定量。
OD260/ OD280比值一般为1.7-1.8，如果洗脱时不使用缓冲液，而使用去离子水，由于受PH值和离子浓度的影响，比值会偏低。
常见问题
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问 题 |
可能原因 |
解决方法 |
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未得到DNA |
漂洗缓冲液和溶液PP使用前未加入无水乙醇 |
请按试剂瓶标签说明在Buffer W1和Buffer W2中加入无水乙醇，并做好标记。 |
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DNA产量低 |
裂解不完全 |
加入蛋白酶K和溶液BL后请立即充分混匀。 |
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细胞最多不超过5×107cells。 |
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确保操作中加入蛋白酶K。 |
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延长裂解时间。 |
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蛋白酶K活性降低 |
蛋白酶K每次使用完毕立即冻存于-20℃。 |
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洗脱缓冲液使用不当 |
使用70℃预热的洗脱缓冲液。 |
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离心时吸附柱堵塞 |
细胞太多 |
减小细胞的初始用量。 |
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