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      酵母质粒小量提取试剂盒

GalaxyBio Code包装规格价格说明书购物车
YP01050Tests420元
YP020100Tests760元

酵母质粒小量提取试剂盒

酵母质粒小量提取试剂盒
              (离心柱型)
 
试剂盒内容
50次货号Cat:YP010
50次货号Cat:YP010
Lyticase (1KU/ml)   
1500μl×2
1500μl×4
RNaseA (10mg/ml)   
150μl
300μl
溶液SE  Buffer SE
15ml
15ml×2
溶液S1 Resuspension Buffer
15ml
30ml
溶液S2 Lysis Buffer 
15ml
30ml
溶液S3 Neutralization Buffer
25ml
45ml
漂洗缓冲液 Wash Buffer
15ml
30ml
洗脱缓冲液 Elution Buffer
10ml
10ml
吸附柱     Spin Column
50
100
收集管   Collection Tube(2ml)  
50
100
说明书     Specification
1
1
 
贮存条件:Lyticase、RNaseA和其他试剂都可以室温保存
 
产品简介     
※  本试剂盒采用酶法或机械破壁酵母细胞,离心吸附柱内的硅胶膜在高盐低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅胶膜上洗脱。
※  采用进口硅胶膜,吸附量大,最大45ug,产率高。
  ※  通常酵母质粒拷贝数都很低,一般通过电泳或者分光光度计法不容易难检测到。提取的质粒DNA 如用于下列实验,通常建议使用量为:
用作PCR 模板:1-5 μl 质粒DNA。
转化大肠杆菌:5-10 μl 质粒DNA。
  ※  获得的质粒直接可以用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
操作步骤:
1.试验前准备及注意事项
 a.溶液S1 Resuspension Buffer加入RNaseA,并标示,4℃保存。
漂洗缓冲液 Wash Buffer使用前请按标签加入无水乙醇并标示。
     b.使用前检查溶液S2 Lysis Buffer ,若有请于37℃或微波炉稍加热溶解。
     c.溶液S2 Lysis Buffer 及洗脱液用后拧紧瓶盖。
2.收集1~5ml培养液,1000xg,离心 5 min,尽量弃去上清。
注意:残余培养液影响酶解.
3.酵母细胞壁的破除:
a.酶法:向菌体中加入 300μl Buffer SE 能,加入大约50μl Lyticase (约50U) ,充分混匀,并在摇床上 220rpm / min , 30℃处理30 min ~1小时。3000 x g离心 5 min,沉淀原生质球,小心弃去上清,收集沉淀。加入 250μl溶液S1 Resuspension Buffer(请先检查是否已加入 RNaseA ) 重悬沉淀。
 
注意:以上 Lyticase 的用量和处理时间为经验值,根据酵母菌株和酵母细
胞数量的不同,所用 Lyticase 的浓度和孵育时间应该进行适当调整。对于
酵母的不同菌株,孵育时间和酶量有所不同,后续操作裂解的程度取决于原生质球的数量。原生质球. 必须小心操作。
 b.玻璃珠法:向菌体中加入 250μl溶液S1 Resuspension Buffer(请先检查是否已加入 RNaseA ) 重悬沉淀,彻底悬浮菌体。加入 0.1g 直径为0.45~0.55mm 的酸洗玻璃珠,涡旋振荡 10 分钟。让玻璃珠自然下沉,转移裂解液至一个新离心管.
.8.  碱裂解  将250μl溶液S2 Lysis Buffer  加入细菌重悬液,温和地上下翻转混合6~10次。
    注意:此步请轻柔混合,剧烈混合如Vortex会导致基因组DNA断裂,从而污染质粒DNA。碱裂解不宜超过5分钟,否则会导致部分质粒DNA不可逆变性。
9.  中和  加入350μl溶液S3 Neutralization Buffer,立即轻柔地上下翻转混合直至蓝色彻底消失。室温放置5分钟。室温12000rpm离心10分钟。
10. 柱结合  将上述操作的上清液转移至吸附柱Spin Column中,13000rpm离心1分钟,弃滤液。
11. 漂洗  将700μl的漂洗缓冲液 Wash Buffer加入吸附柱Spin Column中,12000rpm离心30-60秒,弃滤液。
12. 再漂洗  将500μl的漂洗缓冲液 Wash Buffer加入Spin Column中,12000rpm离心30-60秒,弃滤液。 空柱12000rpm再离心2分钟,除去残留乙醇。
13. 洗脱  将Spin Column按置于新的洁净的1.5ml的离心管上,在吸附柱Spin Column膜的中央处加入30~100μl的水或洗脱缓冲液Elution Buffer,室温静置1分钟,12000rpm离心1分钟洗脱DNA,可立即用于下游分子生物学实验或-20℃保存。
   
注意:Elution Buffer 组成为2.5mM Tris-HCI (pH8.5),不影响测序和酶切反应,。把水或洗脱液加热于60℃使用时有利于提高洗脱液效率,如果提取的质粒>10kb,请将洗脱液预热至60℃,并适当延长洗脱时间。
 
 
质粒DNA浓度和纯度检测
   OD260值为1,相当于50ug/ml的双链DNA。也可以通过DNA Marker通过琼脂糖凝胶电泳半定量。
OD260/ OD280比值一般为1.7-1.8,如果洗脱时不使用缓冲液,而使用去离子水,由于受PH值和离子浓度的影响,比值会偏低。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

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